Как расшифровать данные теста на антитела к коронавирусу: отвечает врач

У ВИЧ-инфицированных людей симптомы могут не проявляться многие годы. Единственный способ диагностировать заболевание – сдать анализ крови и выявить болезнь.

Основной метод лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции 

Основным методом является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% – через 6 месяцев от момента заражения и у 0,5-1% – в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител – 2 недели от момента заражения. В терминальной фазе СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до полного их исчезновения.

Что такое иммуноферментный анализ

Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем – полистироловый планшет с лунками или полистироловые шарики, на поверхности которых сорбирован антиген: вирусный лизат, рекомбинантные белки или синтетические антигенные детерминанты. Из всех модификаций твердофазного иммуноферментного анализа для диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, наиболее широко применяются непрямой и конкурентный варианты.

Как проводится тест

Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь.

‘

05.11.2020 18:40 221640 Для определения антител берут кровь из вены. / Эдуард Кудрявицкий / АиФ Новость по теме «Без выходных и праздников»: как в Прикамье работают COVID-лаборатории Прежде всего, это иммуноферментный (ИФА) анализ, который очень широко распространён и иммунохемилюминисцентный (ИХЛА) методы. Эти методы позволяют получить полуколичественные и количественные результаты.  Для проведения исследований необходимо специальное оборудование. Время получения результата при проведении ИФА-исследования – 2,5 часа, при ИХЛА – 1,5 часа.

Также существуют иммунохроматографические (ИХА) методы – быстрые диагностические экспресс-тесты. Это качественные тесты и позволяет определить наличие или отсутствие антител к SARS-CoV-2. Время получения результата 15-30 минут. 

Что показывает результат анализа?

Он может показать, болеет ли сейчас человек (острая фаза инфекции), начало развития иммунного ответа, выраженный иммунный ответ или инфекция была в прошлом (период выздоровления). Определение тех или иных иммуноглобулинов помогает определить фазы инфекционного цикла. Иными словами, понять – на какой стадии находится заболевание. 

Как делают анализ на антитела?

Материалом для лабораторного исследования является кровь из вены.

Что такое IgA, IgМ и IgG?

Есть три вида антител (иммуноглобулинов) IgA, IgМ и IgG. 

Иммуноглобулин A – это первый иммуноглобулин, который образуется у человека при контакте с вирусом. Он появляется со второго дня заболевания и достигает пика через две недели.

Иммуноглобулин М (IgМ) появляется в среднем на 5-7 день от начала заболевания

Иммуноглобулин G (IgG) – примерно на 7-10 день.

О чём говорят буквы?

Если анализ показал наличие IgМ – это острая фаза заболевания. По-простому, человек болеет.

Если показатель IgМ высокий, но стали появляться антитела IgG, то это означает, что ещё острая фаза заболевания, но начинает формироваться иммунитет. Если через две недели снова сдать кровь, то мы можем увидеть, что антител IgМ становится заметно меньше, но нарастает титр IgG. Это нормальная ситуация, когда человек выздоравливает. Если у человека есть только антитела IgG – то это значит, что он переболел, даже если этого и не заметил. У него сформировался иммунитет к SARS-CoV-2.

Что означают цифры?

Многие пытаются читать и анализировать цифровые показатели, указанные в бланке результата анализа. На самом деле каждая лаборатория работает на своих тест-системах. В инструкциях к этим тест-системам всегда указаны свои референтные значения, свой интервал. Нужно обращать внимание именно эти показатели. Лаборатория обязательно должна указывать в бланке референтные значения.

• 
  Читайте также:

  Как понизить холестерин в крови у мужчин

Но гораздо больше вам скажет соотношение иммуноглобулинов IgМ и IgG – в какой пропорции они находятся. Если больше IgM, то человек болеет, но иммунитет только начал формироваться. Больше IgG – процесс формирования иммунитета в самом разгаре, вы выздоравливаете.

Может ли анализ определить, когда человек столкнулся с возбудителем?

Только в том случае, если он постоянно сдаёт анализ на антитела, что вряд ли кто-то делает. Например, человек регулярно сдавал анализ и вдруг появились IgM, которые, как мы уже знаем, формируются на 5-7 день, а антител IgG ещё нет. Вот тогда можно понять, что он контактировал с возбудителем неделю назад. Но таких людей, бесконечно сдающих анализы, наверное, нет.

Можно ли определить заразность человека?

Напомню, в крови определяют только антитела (иммуноглобулины), но не наличие вируса! А вирус, как известно, передаётся воздушно-капельным путём. Поэтому, чтобы понять, заразен человек или нет, нужно взять мазок из носоглотки. А это уже совсем другой метод – ПЦР – диагностика.

В каких случаях и стоит ли сдавать ПЦР – тест после анализа на антитела?

У людей с клиническими проявлениями новой коронавирусной инфекции обнаружение иммуноглобулинов является подтверждением диагноза.

У тех, у кого заболевание протекает бессимптомно, выявление антител к SARS-CoV-2 имеет вспомогательное значение. Для подтверждения диагноза необходимо сделать ПЦР- исследование.

Кому и когда рекомендуют проводить исследование на наличие антител?

• Тем, кто перенёс инфекцию –  для оценки уровня формирования иммунитета. Такой анализ стоит делать не ранее, чем через 7-10 дней после того, как человек получил второй отрицательный результат ПЦР – теста. Повторить анализ на определение иммуноглобулинов можно через два месяца. Тут всё индивидуально. Если титр IgG со временем уменьшается, то есть риск повторного заболевания.
• Контактировавшим с больным новой коронавирусной инфекцией.
• Для выявления лиц с бессимптомной формой заболевания.

Нужна ли специальная подготовка перед сдачей анализа?

Специальной подготовки не требуется. Накануне вечером не стоит есть жирную или солёную пищу.  Утром можно пить воду или чай.  В общем, обычные требования к забору крови из вены.

Почему анализы порой дают странные результаты?

Да, бывает, что человек болел, были клинические проявления, а антител мало. Или наоборот, клинических проявлений не было (бессимптомное течение заболевания), а антител много. Это всё потому, что инфекция пока ещё малоизученная.

Пермякам разъяснили, что делать с положительным тестом на COVID-19

«Без выходных и праздников»: как в Прикамье работают COVID-лаборатории Тест на COVID-19 прошел каждый четвертый житель Пермского края В погоне за тестом. Нужно ли бежать сдавать анализ на COVID-19? Пермякам разъяснили, что делать с положительным тестом на COVID-19 В Пермком крае коронавирус за сутки выявили у 180 человек

ИФА — это современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови (либо антигенов) к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

В рутинной ветеринарной практике ИФА рекомендован в следующих случаях:

1. поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
2. поиск антигенов каких-либо инфекционных заболеваний;
3. исследование гормонального статуса пациента;
4. обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Как и у любого метода лабораторной диагностики ИФА имеет свои преимущества и свои недостатки. К преимуществам метода относятся:

1. высокая специфичность и чувствительность метода (более 90%);
2. возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнение количества антител в разных временных промежутках;
3. доступность и скорость данного исследования;
4. не инвазивный способ забора материала не исследование;

Недостатком метода является тот факт, что в ходе анализа удается выявить не самого возбудителя заболевания, а только иммунный ответ на него (антитела).

Суть метода ИФА

Выделяют несколько разновидностей ИФА: прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный. Однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA.

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, в результате чего происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

По сути, этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1. на поверхности лунок планшета тест-системы находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении сыворотки крови животного происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом;
2. далее, в лунку добавляется особый хромоген (конъюгат, меченный пероксидазой). Происходит ферментативная реакция, результатом которой является образование окрашенного вещества в лунке планшета. Интенсивность окраски его зависит от количества содержащихся в сыворотке животного иммуноглобулинов (антител);
3. далее происходит оценка результата. С помощью многоканального спектрофотометра, происходит сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб и математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Нужно помнить: для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии («референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования.

Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При оценке результатов на конкретные инфекции имеет значение класс обнаруженных антител и их количество. От этого зависит не только вопрос этиологии инфекции, но и предполагаемая стадия заболевания (острая, хроническая), а также наличие активной инфекции (острой или обострения хронической) на момент обследования.

Каковы приблизительные сроки появления антител?

Самыми ранними антителами являются IgM. Выявить их можно через 1-3 недели после возможного инфицирования, что характеризует острую фазу инфекционного процесса. Вторая ситуация появления антител IgM – обострение хронического процесса.  IgM циркулируют в среднем около 3х месяцев, затем их количество постепенно исчезает. Однако у некоторых пациентов следовые количества IgM могут обнаруживаться в течение 1-2х лет с момента инфицирования.

С 4й недели после инфицирования начинают появляться антитела IgG. При большинстве инфекций титр их постепенно увеличивается с максимумом в разные сроки (в среднем через 1,5-2 мес), далее титр остается на невысоком уровне и указывает на иммунитет. При некоторых заболеваниях уровень IgG не бывает высоким.

Варианты обнаружения антител

• Изолированное обнаружение антител IgM предполагает наличие первичного инфицирования.
• Одновременное выявление в крови IgM и IgG характерно для первичного инфицирования в предыдущие 2-3 месяца, а также при обострении хронического заболевания.
• Выявление изолированно IgG может указывать как на иммунитет к данному заболеванию, так и на хроническую инфекцию. Во второй ситуации имеет значение и количество антител (титр), и изменение этого титра в динамике. Обычно исследования проводят с интервалом в 2-4-6 недель.

Корректное сравнение результатов ИФА, взятых в динамике, возможно только в случае их изготовления в одной и той же лаборатории.

Серологические исследования

Григорьева Тамара Дмитриевна, к.м.н., высшая категория, врач КДЛ, ГКДЦ (вирусологический)

Фалилеева Марина Юрьевна, высшая категория, врач КДЛ, ГКДЦ (вирусологический)

Горохова Анастасия Игоревна, врач КДЛ, ГКДЦ (вирусологический)

Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина, Санкт-Петербург, Россия

Информация о распространении коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего заболевание COVID-19, впервые появилась в конце декабря прошлого года. Очагом инфекции стал китайский город Ухань. За несколько месяцев болезнь охватила более 210 стран мира. 11 марта Всемирная организация здравоохранения объявила пандемию коронавируса.

Коронавирусы (Coronaviridae) – это большое семейство РНК-содержащих вирусов с одноцепочечной положительно заряженной молекулой РНК, способных инфицировать человека и некоторых животных. У большинства пациентов с COVID-19 имеются слабые клинические проявления или симптомы средней тяжести, но у примерно15% больных развивается тяжелая пневмония, а у около 5% – острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и полиорганная недостаточность. Смертность при COVID-19 колеблется от 1 до 5%, наиболее тяжелые формы развиваются у пациентов пожилого возраста с сопутствующими заболеваниями сердечно-сосудистой системы, почек, печени, сахарным диабетом и др. [2, 3, 4]. При острых признаках заболевания исследуют мазки из зева методом ПЦР, который выявляет генетический материал возбудителя (РНК) и подтверждает диагноз.

Выявление антител класса IgG к SARS-CoV-2 важно, прежде всего,  для оценки иммунного статуса при коронавирусной инфекции.

Иммуноглобулины G (IgG) синтезируются последними, через 5-6 недель с момента попадания вируса в организм, и сохраняют информацию о коронавирусе. Обычно IgG являются архивом памяти перенесеных инфекций, в большинстве случаев пожизненно, либо на несколько лет. Механизмы развития иммунной реакции на коронавирус пока изучаются. Неясно, стойкий иммунитет формируется или нет. Это предстоит узнать. Но в любом случае, выявление IgG свидетельствует о факте попадания коронавируса в организм и иммунном ответе организма.

Для детекции IgG к SARS-CoV-2 в настоящее время используется множество тест-ситем, зарегистрированных в РФ. Это тест-системы, основанные на иммунохроматографическом методе (экспресс-тесты), методе  ИХЛА  и методе ИФА.

Лаборатории чаще подтверждают скрининговые исследования зарубежными тестами (“Рош Диагностикс ГмбХ”, Германия, “Эбботт Ирландия, Диагностическое подразделение” Ирландия), а для выявления работают с тестами российских производителей. Соответствие  диагностических характеристик, заявленным в инструкции,  и  удобство с точки зрения лаборанта – основные требования, предъявляемые  к тестам при большой загруженности лаборатории.

В настоящее время в медицинском и лабораторном профессиональном сообществе огромное значение придается точности анализов биологических жидкостей. Строгое соблюдение инструкций производителя, несомненно, способствует повышению качества диагностики. Большое внимание уделяется системам внешней оценки качества исследований, однако, по современным научным данным, известно, что использование результатов внешнего контроля качества не всегда возможно из-за появления т.н. матричных эффектов, существующих во многих материалах, используемых для внешнего контроля. Как правило, материалы, используемые для контроля качества, подвергаются ряду обработок (заморозка, лиофилизация,  добавление посторонних веществ), поэтому ведут себя не так, как свежие образцы биологических жидкостей, анализируемые в рутинной практике. Таким образом, появляется феномен матрикс-эффектов, включающий в себя взаимодействие четырех компонентов: прибора-анализатора, состава реагентов, самого метода, а также способа обработки и состава аналитов и контрольных материалов.

Существует способ оценки матрикс-эффекта, основанный на том, что соотношение между наблюдаемым ответом (результатом исследования) и фактической концентрацией вещества зависит от условий окружающей среды (в том числе, матрикса) во время процесса исследования. Величину возможного матрикс-эффекта можно оценить по степени разброса результатов, полученных двумя сравнимыми методами в случае использования репрезентативной выборки аликвот пациентов. Для выполнения данного сравнительного анализа можно использовать обычно используемый (часто используемый) метод для данного вида исследования.

Целью данной работы была оценка возможного матрикс-эффекта при использовании Набора реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG», производства компании Алкор Био.

Материалы и методы:  Нами были исследованы сыворотки 93 пациентов на наличие IgG-антител к коронавирусу SARS-CoV-2. В качестве тест-системы сравнения использовался Набор реагентов «SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ», применяемый в рутинной лабораторной практике.

В наборе «SARS-CoV-2ИФА-IgG» производства Алкор Био  использован вариант непрямого, двустадийного твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта рекомбинантный белок, соответствующий закодированному в геноме вируса белку, иммобилизован на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок). Во время первой инкубации происходит связывание специфических иммуноглобулинов, содержащихся в исследуемом образце, с антигеном твердой фазы. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. Во время второй инкубации антитела к иммуноглобулинам G человека, конъюгированные с пероксидазой хрена, связываются с иммунокомплексом, образовавшимся на первой стадии. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству иммуноглобулинов G в исследуемых пробах. Наличие IgG оценивается относительно значения индекса позитивности.

Результаты сравнительного определения IgG-антител к  коронавирусу SARS-CoV-2 в лаборатории СПб ГБУЗ «Больница Боткина» ГКДЦ (вирусологический) представлены в Таблице 1. Сравнительная таблица коэффициентов позитивности определения IgG-антител к к коронавирусу SARS-CoV-2.

*коэффициент позитивности

Дополнительно были исследованы 83 отрицательных образца. Значимых расхождений в результатах исследования сывороток крови пациентов на наличие иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 при использовании тест-систем вышеуказанных производителей, получено не было.  Таким образом, влияние матрикса при использовании Набора реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG», производства компании Алкор-Био, доказано не было.

Как видно из приведенной таблицы, значимых расхождений в результатах исследования сывороток крови пациентов на наличие иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 при использовании тест-систем вышеуказанных производителей, получено не было.  Таким образом, влияние матрикса при использовании Набора реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG», производства компании Алкор-Био, доказано не было.

Также при использовании данной тест-системы нами был отмечен ряд преимуществ, а именно:

1. Короткий по времени цикл ручной постановки (1 час 20 минут);

2. Цветная окраска контрольных проб, аналитического буфера, конъюгата;

3. Изменение цвета аналитического буфера при внесении испытуемого образца (со светло-зеленого на голубой), что исключает пропуск лунки или неправильное внесение образца;

4. При определении титров антител предусмотрено разведение образцов с КП ≥6,6;

5. Наличие в инструкции производителя таблицы пересчета КП в титры АТ для образцов, разведенных в 10 раз. Возможность выдавать ответ в КП или титрах антител;

6. Стабильность окраски в лунках планшета до 20 минут (удобно в случае невозможности измерения ОП сразу после остановки ферментативной реакции);

7. Отсутствие этапа предварительного разведения сывороток, что исключает ошибки при разведении и внесении образцов в рабочий планшет;

8. Возможность адаптации протокола исследования для постановки на автоматических ИФА-анализаторах открытого типа;

Таким образом, без предварительного разведения сывороток в 100 раз набор показывает достоверные результаты.

Набор реагентов для качественного и полуколичественного иммуноферментного определения иммуноглобулинов G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке и плазме крови человека «SARS-CoV-2ИФА-IgG» производства компании Алкор Био, может быть рекомендован к использованию в рутинной лабораторной практике.

Список литературы:

1. Louis Grandjean, et al. // Humoral Response Dynamics Following Infection with SARS-CoV-2. // medRxiv, 2020, DOI:  10.1101/2020.07.16.20155663

2. Xiang-Yang Yao, et al. // Neutralizing and binding antibody kinetics of COVID-19 patients during hospital and convalescent phases. // medRxiv, 2020, DOI:  10.1101/2020.07.18.20156810

3. Ania Wajnberg, et al. // Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months. // Science, 2020: eabd7728, DOI: 10.1126/science.abd7728

4.  Daniel F. Gudbjartsson, et al. // Humoral Immune Response to SARS-CoV-2 in Iceland. // NEJM, 2020, ; 383:1724-1734, DOI: 10.1056/NEJMoa2026116

5. Guillaume Beaudoin-Bussières, et al. // Decline of Humoral Responses against SARS-CoV-2 Spike in Convalescent Individuals // mBio, 2020; DOI:  10.1128/mBio.02590-20

6. МЗ РФ. Временные методические рекомендации “Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Версия 9 (26.10.2020)”. С. 33-36